作物育种技术常用的有9种:远源杂交、自交不亲和、杂种优势利用、单倍体育种、多倍体育种、基因组编辑、全基因组选择、分子设计育种、转基因育种。
传统遗传育种方法是建立在有性杂交的基础上,通过遗传重组和表型选择进行新品种选培。随着所用品种遗传多样性逐步减少,传统育种瓶颈效应愈来愈为明显,利用常规育种技术已经很难育成突破性新品种。生物技术的创新极大地推动了现代育种的发展。随着分子生物学、基因组学、系统生物学、合成生物学等学科的发展和生物技术的不断进步,多学科联合催生了设计育种技术的革新。2017年生物技术发展迅猛,各项技术得到了空前的发展,尤其是基因组编辑技术、单倍体育种、分子设计育种技术的发展,正孕育着一场新的育种技术革命。
1、基因组编辑技术
基因组编辑是生命科学新兴的颠覆性技术,特别是基于CRISPR?Cas9系统的基因组编辑工具近几年迅猛发展。在过去的一年里,基因组编辑技术得到空前发展。
1)作物基因组单碱基编辑方法的建立
在作物育种中,通过简单的方法将遗传变异引入到现代优异品种中是加速遗传改良、推进育种进程的重要手段。在过去的一年里,不同课题组分别建立了单碱基编辑方法,并在不同作物中进行了尝试。
中国科学院上海生命科学研究院朱健康课题组在水稻中利用大鼠APOBEC1系统开发了一种单碱基置换方法。类似于哺乳动物“碱基编辑”系统,该研究小组合成了大鼠APOBEC1,并利用非结构化的16残基肽XTEN作为接头,将其融合到Cas9(D10A)的N末端。将一种核定位信号(NLS)肽添加到Cas9(D10A)的C末端。半主动式的Cas9可切割非编辑的链,并通过诱导碱基切除修复,增加碱基编辑的效率。然后,在玉米泛素启动子(UBI)的控制下,这个APOBEC1?XTEN?Cas9(D10A)融合序列被构建成一个双运载体。研究人员在水稻上对两个重要的基因NRT11B和SLR1进行了编辑,数据表明,采用这种改进的CRISPR/Cas9系统,可以有效地产生稳定C→T和C→G(G→A和G→C)替换。同期,中国农业科学院作物科学研究所夏兰琴研究组与华中农业大学“千人计划”引进人才、美国加州大学圣地亚哥分校赵云德教授实验室合作,也报道了利用改造后CRISPR/Cas9系统,成功在水稻中实现靶标基因高效单碱基定点替换。
日本神户大学及筑波大学的三个研究团队通过借鉴哺乳动物单碱基编辑方法,成功在水稻及番茄中建立了Target?AID单碱基定点编辑技术体系。Target?AID系统由海七鳃鳗胞苷脱氨酶基因PmC?DA1(Petromyzonmarinuscytidinedeaminase)和两种Cas蛋白变体nCas9(nickaseCRISPR/Cas9)或dCas9(nuclease?deficientCas9)及sgRNAs融合而成。研究人员首先通过EGFP报告系统成功实现C至T碱基的替换,dCas9Os?PmCDA1At和nCas9Os?PmCDA1At处理的效率分别为43%和183%;继而以水稻中的除草剂靶标乙酰乳酸合成酶基因(acetolactatesynthase,ALS)作为编辑的目标,dCas9Os?PmCDA1At和nCas9Os?PmCDA1At均可创造287位点上C→T的碱基突变(A96V的氨基酸替换),从而获得对除草剂甲氧咪草烟的抗性,效率分别为156%和341%;进一步的研究发现该系统可实现三个位点(靶向两个基因FTIP1e和ALS)的同时单碱基编辑。该系统在双子叶植物番茄中也实现了高效的编辑。研究人员选取与激素信号相关的内源基因DELLA和ETR,利用未经过密码子优化的PmCDA1载体nCas9At?PmCDA1Hs以及通过拟南芥密码子优化的PmCDA1载体nCas9At?PmCDA1At均可实现单碱基编辑并最终获得了单碱基突变可稳定遗传且marker?free的番茄突变体。另外,在T0代编辑的植物中发现有部分非预期的基因片段缺失或插入还有一些C至G突变类型。
中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞课题组在前期工作基础上,借鉴哺乳动物单碱基编辑方法,利用Cas9变体(nCas9?D10A)融合大鼠胞嘧啶脱氨酶(rAPOBEC1)和尿嘧啶糖基化酶(UGI),构成了高效的植物单碱基编辑系统nCas9?PBE,成功地在三大重要农作物(小麦、水稻和玉米)基因组中实现高效、精确的单碱基定点突变。通过在原生质体中对报告基因BFP以及三种作物中五个内源基因七个位点突变结果的详细分析,发现nCas9?PBE可实现对靶位点DNA的C至T替换,C碱基脱氨化的窗口覆盖靶序列的7个核苷酸(距离PAM远端的第3?9位);其中单个C的替换效率为039?707%,多个C的替换效率高达1248%。通过遗传转化,利用该体系获得了靶标区域单碱基替换的小麦、水稻和玉米突变植株,突变效率最高可达4348%。该技术无需在基因组的靶位点产生DNA双链断裂(DSB),也无需供体DNA的参与,具有简单、广适、高效的特点。nCas9?PBE单碱基编辑系统成功建立和应用,为高效和大规模创制单碱基突变体提供了一个可靠方案,为作物遗传改良和新品种培育提供了重要技术支撑。
这些研究成果不仅丰富了单碱基编辑的技术手段,而且为现代作物育种提供了前景广阔的现代育种新方法。
2)基因组编辑效率与精度的改良
如何提高Cas9编辑效率和避免脱靶是目前限制其发挥巨大潜力的最主要问题,提高该系统的效率和特异性一直是基因组编辑方法研究的焦点。
中国农业科学院水稻研究所王克剑课题组和中科院遗传所李家洋课题组合作,通过优化sgRNA的结构以及使用水稻内源性强启动子来驱动Cas9?VQR变体的表达,成功将CRISPR?Cas9?VQR系统的编辑效率提高到了原有系统的3到7倍。
中国科学院?马普计算生物学研究所杨力研究组与上海科技大学陈佳研究组、杨贝副研究员开展合作研究,利用共表达尿嘧啶糖苷酶抑制剂(uracilDNAglycosylaseinhibitor,UGI)的方法,开发了一种基于碱基编辑器3(baseeditor3,BE3)的增强型碱基编辑器(enhancedbaseeditor,eBE),实现了更高准确度的基因组单碱基编辑。
通过蛋白质工程的方法,美国两个课题组前期分别对Cas9蛋白进行定向改造,获得了三种特异性显著提高的Cas9蛋白变体:eSpCas9(10)、eSpCas9(11)和SpCas9?HF1。中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组近期的研究发现,这三种高保真的SpCas9核酸酶的基因组编辑活性会严格受到sgRNA向导序列(guidesequence)长度的影响。将向导序列设为与靶位点精确匹配的20个碱基,是确保三种高保真SpCas9核酸酶活性的重要前提。为此,高彩霞研究团队将水稻tRNAGlu序列融合到U3启动子和sgRNA之间,利用细胞內源的RNaseP和RNaseZ将未成熟的sgRNA中的向导序列加工成为与靶序列精确匹配的20个碱基,通过这一策略能够将eSpCas9(10)、eSpCas9(11)和SpCas9?HF1的活性保持在与野生型SpCas9相当的水平,并且还保持其特异性。
丰富的遗传变异和高效的筛选体系是限制作物育种的主要因素。基因组编辑技术开创了作物遗传改良的新途径。得益于功能基因组学的研究成果,基因组编辑技术已在控制作物质量性状的功能基因改良中得到应用。与功能基因丰富的遗传变异不同,调控功能基因表达模式的顺式调控序列的自然变异有限。挖掘和创制顺式调控序列的遗传变异,不仅有助于阐明数量性状的调控模式,而且对于作物遗传改良意义重大。冷泉港实验室的番茄育种家Lippman研究组通过系统的试验证实:(1)通过CRISPR/Cas9靶向顺式调控基序能够重建人工驯化的数量性状位点;(2)多重gRNA介导的CRISPR/Cas9对启动子区域进行编辑能够创制出新的、连续的性状变异;(3)跨代CRISPR/Cas9驱动的遗传编辑体系能够高效地筛选和评价数量性状变异;(4)新创制的顺式调控序列等位变异能够在非转基因后代中得到固定;(5)顺式调控序列保守区的变异及其对转录的影响不可以通过表型差异来预测。
利用人工转录因子同时激活生物体内多个基因在是一种强大的生物工程和系统生物学工具。转录激活子VP64与dCas9融合可以促进靶向基因的表达,但只能较小程度地提高转录水平。目前报道的三种基于dCas9技术的转录激活系统(VPR,SAM和SunTag)在动物细胞中得到很好的应用,但在植物中还没有一种有效的转录激活系统。中山大学李剑峰教授研究团队报道了一种植物中的高效的转录激活系统dCas9?TV,与dCas9?VP64相比,dCas9?TV在单基因或者多基因的激活方面都表现的比较强的激活效率,另外研究表明,该系统同样适用动物细胞。
几乎同时,美国马里兰大学戚益平实验室和中国电子科技大学张勇实验室合作开发了两套分别基于CRISPR?Cas9和TALE的高效植物转录激活系统。第一套转录激活体系基于CRISPR?Cas9系统。通过在拟南芥和水稻中测试转录激活的多种策略,研究发现通过dCas9和经修饰的gRNA支架gRNA20(CRISPR?Act20)同时富集转录激活子VP64,要比同实验室之前在2015年报道的第一代dCas9?VP64更具转录激活效应。CRISPR?Act20系统成功的在水稻细胞中进行多基因激活,表明该系统在植物基因调控中具有很好的应用前景。第二套的转录激活体系是一个多重转录激活剂样效应物激活mTALE?Act系统,用于植物中多重转录激活。该系统允许将多达四个TALE?VP64基因快速装配成单个T?DNA载体,以同时激活植物中多达四个基因。通过在拟南芥中打靶PAP1,作者证实mTALE?act要比CRISPR?Act20更有效地激活内源基因表达。因此,这个mTALE?Act系统是一个强大的转录激活系统,可同时上调植物中的多个基因。
3)高通量基因组编辑库的建立
在植物中,利用CRISPR/Cas9/Cpf1系统进行基因编辑的步骤主要包括了特异性靶点的选择,sgRNA表达盒的设计,转化载体的构建与转化,以及后续对突变体的靶点突变的序列分析。
华南农业大学生命科学学院刘耀光研究组对已经开发的“DSD简并序列解码法”及其在线软件工具DSDecode进行了改良,增加了配套的软件工具,并对网站硬件做了全面系统的升级,推出了一站式服务的在线基因组编辑工具软件包?CRISPR?GE(ht?tp://skl.scau.edu.cn/)。该软件包由一系列功能联动的多个子程序构成,包括特异性靶点的设计(tarDesign),潜在脱靶位点评估(offTarget),构建sgRNA表达盒和扩增与测定靶点序列的引物设计(primerDesign),以及对目标靶点突变的分析(DS?DecodeM)等。这些功能涵盖了植物基因组编辑实验中的主要步骤,可以极大地帮助研究人员高效利用CRISPR系统进行基因组编辑的设计和结果分析。另外,该软件包还提供了一个方便下载参考基因组特定区间序列的工具(seqDownload),用户只需输入目标基因号或小段标记序列,指定要下载的基因(标记)上下游序列的长度,即可下载对应的基因组片段序列。该软件包还支持对若干个动物基因组编辑的靶点设计和基因组片段序列的下载。
水稻突变体是进行水稻功能基因组学基础研究和水稻分子设计育种的重要材料。常规的水稻突变体来源于自发突变或化学、物理及生物的诱变,具有很大的随机性和局限性,不能满足大规模的水稻功能基因组学研究和水稻分子设计育种的需求。利用高效便捷的CRISPR/Cas9基因组编辑技术和高通量的寡核苷酸芯片合成技术可以大规模地对水稻全基因组进行编辑,实现水稻突变体的高通量构建和功能筛选。中国科学院遗传与发育生物学研究所李家洋研究组和高彩霞研究组合作,通过农杆菌介导的水稻遗传转化法,以水稻中花11作为受体材料,对水稻茎基部和穗部高表达的12802个基因进行高通量的基因组编辑,获得了14000余个独立的T0代株系,并对它们的后代进行了部分表型和基因型分析鉴定。同期,百格基因公司研究团队也公布了他们利用CRISPR/Cas9系统构建水稻突变体库的研究进展,获得了84万个突变植株,随机抽取部分转基因植株分析后表明,突变频率可以达到80%以上。
这些研究表明,利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术大规模构建水稻突变体库并进行功能筛选是高效便捷获得水稻重要突变体和快速克隆对应基因的有效方法,同时能够为水稻分子设计育种提供重要的供体材料。
4)育种公司对基因组编辑技术的关注
2017年1月4日,孟山都宣布与哈佛大学?麻省理工学院的Broad研究院就新型的CRISPR?Cpf1基因组编辑技术在农业中的应用达成全球许可协议。新的CRISPR?Cpf1系统与CRISPR?Cas9系统相比,在针对性的改善细胞DNA方面有望变得更加简单和精确,是基因编辑技术领域的重大进展。研究人员认为CRISPR?Cpf1系统相较于CRISPR?Cas9,在改善农业产品方面具有更多优点,例如编辑方式以及编辑发生位点更加灵活;CRISPR?Cpf1系统体积更小,能够更加灵活的运用于多种作物。CRISPR?Cpf1系统的专利独立于CRISPR?Cas专利,这个新的系统将为孟山都在基因编辑这个迅速发展的科学领域提供另一个更有价值的工具。
2017年7月,Evogene宣布发现镰刀菌抗性基因,目前表现最好的一部分基因已在孟山都的玉米产品研发线上进行测试。同时,Evogene宣布完成了玉米和大豆产量及非生物胁迫逆境性状候选基因的筛选,发现了约4000个与作物性状相关的基因。同年9月,Evogene公司宣布利用基因组编辑技术改良的抗黑叶斑病香蕉获得成功。两年的田间试验结果证实,该基因编辑香蕉品种能够提高对黑叶斑病的抗性,并预计于2018年底开展第三年田间试验。
2017年8月16日,孟山都宣布和ToolGen公司就CRISPR技术平台在农业领域的应用达成全球许可协议。ToolGen是一家专注于基因编辑的生物技术公司,是基因编辑研究领域的先驱。上述许可协议的签署,授权孟山都在植物应用领域使用ToolGen全套CRISPR知识产权保护技术。
2、单倍体育种机理研究
单倍体诱导也具有巨大的商业育种价值,最近几十年,单倍体育种已经广泛应用于玉米育种中,利用单倍体诱导产生单倍体然后加倍产生纯合的二倍体,可以大大加快育种进程,解析单倍体诱导形成的机制将有利于进一步提高诱导率,助力作物的遗传改良。
尽管双受精是开花植物所特有的生殖方式,但现在有越来越多的植物育种者试图“绕过”这一过程,而是通过对诱导的单倍体采用药剂处理从而产生双单倍体来完成开花植物的繁衍。由于产生的双单倍体自交系能够直接稳定单倍体所携带的遗传变异,从而可以加速育种进程。植物组织培养目前已普遍应用于作物育种,但以种子生产为目标的双单倍体育种体系还很少有研究以及大规模成功应用。Stock6是玉米中发现的第一个孤雌生殖诱导系,于1956年被首次报道,并在随后几十年的玉米单倍体诱导中广为应用。但有关玉米Stock6及其衍生系诱导单倍体的分子机理并不十分清楚。先正达公司的Kelliher等通过图位克隆,基因组重测序,遗传互补以及基因编辑等方法,证实玉米中单倍体诱导是由一个花粉特异表达的磷酸酯酶基因MATRILIN?EAL(MTL)移码突变造成的。通过基因编辑获得的mtl突变体可以达到67%的单倍体诱导率。MTL定位于花粉母细胞质中,并且通过对花粉转录组RNA?seq分析表明,在单倍体诱导过程中,一系列花粉特异表达的基因均显著上调,这些过表达基因很可能部分参与了单倍体种子的形成。该研究成果表明雄配子细胞质成分对于有性生殖过程的顺利完成以及雄配子所携带染色体组在后代中的稳定传递均起了重要的作用[14]。值得一提的是,2月4日,中国科学家(中国农大的陈绍江教授、金危危教授及华中农大的严建兵教授团队)联合在MolecularPlant上同样也报道了该诱导基因(基因命名为ZMPLA1)。鉴于MTL基因在农作物中的保守性,这一发现有助于在其它农作物中发展单倍体诱导体系来加速育种进程。
玉米中存在天然的单倍体诱导系:当诱导系与普通玉米材料杂交之后,后代有一定几率产生仅含有普通玉米材料染色体的单倍体个体。剖析单倍体诱导过程对理解染色体行为及遗传稳定与物种进化的关系有重要价值。华中农业大学玉米团队严建兵课题组与中国农业大学金危危课题组合作利用单核测序技术,初步解析了玉米单倍体诱导的机制。该研究首先利用显微观察证明诱导系花粉减数分裂过程中染色体行为并无异常,近而利用单细胞单核测序技术发现诱导系成熟花粉的精核中存在高频的染色体片段化,这些结果表明发生于花粉有丝分裂时期的精子染色体片段化是造成受精后染色体消除及单倍体诱导的直接原因。该研究结果为进一步研究单倍体诱导的分子机制提供理论支持,有利于进一步提高诱导率,助力作物的遗传改良。
3、转基因技术进展
发展高效、安全的新型遗传转化方法,一直是基因工程、分子生物学和遗传育种等领域的研究热点之一。传统植物转基因方法,通常需要比较繁杂的组织培养等植物再生程序,才能获得转基因植株,尤其像诸如棉花等难再生作物的转基因植物制备更加困难。中国农业科学院环发所崔海信研究员领衔的“多功能纳米材料及农业应用”创新团队同生物所的“作物分子育种技术”创新团队合作在纳米生物技术研究方面取得重要突破。合作团队通过利用磁性纳米粒子作为基因载体,创立了一种高通量、操作便捷和用途广泛的植物遗传转化新方法。此次研发的基于磁性纳米颗粒基因载体的花粉磁转化植物遗传修饰方法,可以利用Fe3O4磁性纳米颗粒作为载体,在外加磁场介导下将外源基因输送至花粉内部,通过人工授粉利用自然生殖过程直接获得转化种子,然后再经过选育获得稳定遗传的转基因后代。该方法将纳米磁转化和花粉介导法相结合,克服了传统转基因方法组织再生培养和寄主适应性i2等方面的瓶颈问题,可以提高遗传转化效率,缩短转基因植物培育周期,实现高通量与多基因协同并转化,适用范围与用途非常广泛,对于加速转基因生物新品种培育具有重要意义,并在作物遗传学、合成生物学和生物反应器等领域也具有广泛应用前景[17]。该研究推动纳米载体基因输送与遗传介导系统研究取得了重要进展,开辟了纳米生物技术研究的新方向。
2017年6月15日,美环保署首次批准了孟山都以RNA干扰技术为基础研发的一种特殊杀虫剂?DvSnf7双链RNA(dsRNA)。DvSnf7双链RNA作为杀虫剂产品将会添加到SmartStaxPro转基因玉米中,当西方玉米根虫开始取食植物时,这种植物自己产生的DvSnf7双链RNA能够干扰玉米根虫一个重要的基因,进而杀死害虫。孟山都预计这款RNAi转基因玉米将于2020年上市。
4、分子模块设计育种的发展
不同团队分别在不同作物上开展了分子模块设计育种的探索,在过去的一年里,分子设计育种取得了较好的进展。以中国科学院遗传与发育生物学研究所李家洋团队为例,与中国农科院水稻所、深圳农业基因组所钱前研究组联合,经过精心设计,以超高产但综合品质差的品种“特青”作为受体,以蒸煮和外观品质具有良好特性的品种“日本晴”和“93?11”为供体,对涉及水稻产量、稻米外观品质、蒸煮食味品质和生态适应性的28个目标基因进行优化组合,经过8年多的努力,利用杂交、回交与分子标记定向选择等技术,成功将优质目标基因的优异等位聚合到受体材料,并充分保留了“特青”的高产特性。这些优异的“品种设计”材料,在高产的基础上,稻米外观品质、蒸煮食味品质、口感和风味等方面均有显著改良,并且以其配组的杂交稻稻米品质也显著提高。这项研究结果将极大推动作物传统育种向高效、精准、定向的分子设计育种转变[18]。最近,其研究团队与浙江省嘉兴市农业科学院合作,运用“分子模块设计”技术育成的水稻新品种“嘉优中科系列新品种”获得了丰收,种植嘉优中科1号水稻品种的两块田实收测产表明,平均亩产分别为913公斤和9095公斤,比当地主栽品种亩产增产200公斤以上。
不同复杂性状间的耦合是分子设计育种的关键科学问题。作物的产量、品质等大都是多基因控制的复杂性状,由于受到一因多效和遗传连锁累赘的影响,使某些性状在不同材料和育种后代中协同变化,呈现耦合性相关。解析复杂性状间耦合的遗传调控网络,明确关键调控单元,对分子设计育种具有重要意义。中国科学院遗传与发育生物学研究所田志喜研究员联合王国栋研究员、朱保葛研究员、华盛顿州立大学张志武研究员等多家研究团队深入解析了大豆84个农艺性状间的遗传调控网络,揭示了不同性状间相互耦合的遗传基础,发现其中重要节点基因对不同性状的形成起到关键调控作用。该研究为大豆的分子设计育种提供了重要的理论基础,对于提高大豆的品质和产量具有非常重要的意义,同时也为其他作物性状耦合研究提供了借鉴。
目前,大批水稻、小麦、玉米和大豆分子模块育种品系正在区域性生产评比试验中,对作物新品种培育起到了重要推动作用。
5、大数据育种的发展
大数据正快速发展为发现新知识、创造新价值、提升新能力的新一代信息技术和服务业态,已成为基础性战略资源。各个国家和各大育种公司也在大力推进大数据育种。2017年主要动态如下:
NRGene是一家全球领先的基因组大数据公司,该公司开发的GenoMAGICTM平台能够分析海量的基因组数据,鉴别出广泛的序列多态性和单体型,使基因组选择和性状定位更加高效。目前,该软件被全球多家种子公司以及学术研究团队广泛采用,大数据的加速使用使育种的年限和成本都得到大幅的缩减。
2017年1月5日,先正达宣布与NRGene进一步加强合作,选择使用基于云计算的软件GenoMAGICTM,以加快性状开发和作物育种的进度。此前,先正达与NRGene已开展了为期两年的合作,并对GenoMAGIC软件进行测试,评估分析了该软件所带来的好处。这次两家公司开展进一步的合作,以期更全面广泛的评估GenoMagic在整个育种过程的收益。
2017年1月12日,孟山都与NRGene公司就先进基因组分析技术达成了全球性多年的、非排他专利许可协议。该合作将有助于孟山都研发人员从其海量的遗传学、基因组和性状信息数据库,更好地预测、比较并筛选出最佳的遗传修饰,进一步提升孟山都在基因组筛选、性状发现以及基因组改造领域的研发能力。
2017年6月14日,孟山都宣布与Atomwise公司达成合作,利用Atomwise旗下人工智能技术AtomNet加速挖掘和开发新的作物保护产品。补充了该公司对作物保护发现的独特合作方式。Atomwise公司开创性的AtomNet技术能够通过强大的深度学习算法和超级计算机来分析百万个潜在的作物保护产品分子,预测哪些分子可能对控制疾病和害虫产生积极影响,缩短前期研发时间。目前,孟山都是农业界首家与Atomwise合作的公司,并计划将AtomNet这一人工智能系统与其公司旗下育种、生物技术、作物保护、农业生物学和数据科学平台几大业务进行有效结合,缩短新产品的研发时间,及时推出能帮助农民获得更高种植收益的新产品。
可以预见,随着大数据的发展,作物数量遗传学、全基因组关联分析、作物基因组编辑技术将不断突破和改进,通过定点编辑、定点修饰顺式调控序列、定点激活基因表达实现对数量性状的精准操控,必将引领新一轮的育种技术革命。
6、未来育种技术发展
性状的形成同时受到基因型和环境的影响。即使生物体本身也是一个复杂的整体,是多模块互作的系统。涉及多尺度、多过程、多层次的调控。复杂性状多维控制是育种的巨大挑战。大数据、人工智能和基因组编辑技术的发展为未来育种带来机遇,一些颠覆性的技术也正在孕育。未来育种技术的发展应该会向精准、高效、智能方向发展。
来源:植物遗传资源学报 2018,19(3)
作者:梁翰文 吕慧颖 葛毅强 魏珣 邓向东 杨维才 田志喜