摘要：为了更好的理解如何提高商品疫苗产生更好的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的免疫效果，本研究在田间条件下进行了不同免疫方案的对比，包括一次灭活疫苗（INV），一次活疫苗，以及活疫苗和灭活疫苗的组合使用。试验1（E1），21头猪分为三组，A组动物在2.5，3.5和6.5月龄免疫商品灭活疫苗；B组动物在1.5，2.5，5.5和6.5月龄免疫灭活疫苗，C组为对照组，不免疫。所有猪在7.5月龄时攻毒，观察21天。试验2（E2），32头猪均分为4组，A组，B组，C组均在1.5月龄免疫商品活疫苗，D组为对照组。A组和C组于4.5月龄免疫灭活疫苗，B组第二次免疫活疫苗。C组于第二次免疫后一个月再免疫一次灭活疫苗。所有猪在6.5月龄进行攻毒。两个试验中，对比不同免疫方式的总抗体，中和抗体（NA）和细胞免疫（CMI），以及攻毒后的病毒血症的差异。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征，免疫，细胞免疫，中和抗体
试验1中，免疫两次和多次灭活疫苗后均可诱导高水平的的Y干扰素（IFN-Y）反应。免疫灭活疫苗的猪与未免疫的对照猪相比，攻毒后可以更快产生中和抗体。试验2中，再次免疫灭活疫苗的猪和再次免疫活疫苗的猪产生的中和抗体情况相似。但是，只有C组动物中和抗体滴度在攻毒后明显升高。在诱导细胞免疫反应方面，活+死这样的组合免疫方案要优于单独使用活疫苗。总之，一次免疫的话，活疫苗可以诱导最好的免疫反应。之后，再次免疫灭活疫苗是最好的免疫方案，可以诱导更好的免疫反应。
背景介绍
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）在北美首次发现。至今已超过20年。现在PRRSV仍然是猪的主要传染病病原之一。PRRSV属于动脉炎病毒属，有2个基因型：基因Ⅰ型（欧洲型）和基因Ⅱ型（美洲型）。PRRSV感染母猪，可以引起流产，死胎和木乃伊胎，以及其他繁殖障碍。感染断奶仔猪和生长猪群，会引起猪呼吸道综合征。
PRRSV在猪场中持续存在，导致PRRS成为地方性疾病。尤其在非免疫母猪比例增加时，或者在新的强毒株进入猪场时，PRRS会频繁发生。维持母猪有足够的免疫水平是减少感染所必需的。商品化的PRRS疫苗可以诱导免疫，减少繁殖障碍，至少对基因Ⅰ型是有效的。尽管如此，由于PRRSV的基因多样性和同一个基因型的毒株众多，现有商品疫苗的保护力往往是有限的。因此需要新的免疫策略在一定程度上克服PRRSV基因多样性的特点，为猪群提供可靠的免疫水平。
PRRS商品活疫苗和灭活疫苗均为基因Ⅰ型的。灭活疫苗安全性高但是免疫原性较低，而活疫苗有较高的免疫原性，但能否用于怀孕母猪仍存在疑虑。疫苗免疫的安排也主要依据后备猪是如何驯化的，尤其是被选中的后备母猪在进入隔离/驯化设施前后均有可能接触到PRRSV。
普遍认为一头份的灭活疫苗不能诱导明显的免疫反应，但是重复接种灭活疫苗可以诱导高水平的细胞免疫（CMI）。已经感染PRRSV或者免疫过PRRS活疫苗的猪在免疫灭活疫苗后产生的免疫反应也很高。在此基础上，可以参考其他动物疫苗的免疫方案，用PRRS活苗+死苗的免疫组合策略来抵抗PRRSV的感染。
本研究对比了不同的PRRS疫苗免疫方案，包括灭活疫苗，活疫苗和活苗死苗组合使用。目的是探究商品疫苗如何尽可能做到安全有效的驯化后备母猪和免疫经产母猪，以及多次疫苗接种对PRRSV特异性免疫的影响。
材料和方法
所有试验通过了巴塞罗那大学动物和人类试验福利委员会的批准（批准文号：665）.
试验1设计
试验1和试验2的整体设计见表1。试验1中，21头4周龄健康仔猪（长白×大白）随机从猪场挑选。该猪场为PRRSV和猪瘟，非洲猪瘟，猪伪狂犬病阴性场。之后将动物转移至试验猪场，标记耳牌，随机分为三组，每组7头。A组动物在2.5，3.5，6.5月龄分别肌肉注射商品灭活疫苗，2 ml/头（Progressis，Merial：P120株，在试验室条件下接种2次后，免疫荧光检测抗体滴度 ≥ 2.5log10）佐剂类型为水包油。B组动物在1.5，2.5，5.5和6.5月龄分别免疫同样的灭活疫苗。C组动物在其他组动物免疫时接种疫苗佐剂作为安慰剂。
最后一次免疫后3周，将试验猪转移至动物卫生中心（CReS A）饲养7天适应新的环境。7.5月龄时所有猪攻毒，每头猪鼻内接种2ml，病毒量为1×106 TCID50的PRRSV 2749株病毒液。该毒株与Lelystad病毒株ORF5的同源性达到99%. 攻毒后观察21天，每天监测临床症状及发热情况。
试验2设计
断奶时随机挑选32头猪（来源同试验1）转移至试验猪场（同试验1）（见表1）。6周龄时随机分为4组，每组8头。A，B，C组均免疫PRRS商品活疫苗（Porcilis PRRS，MSD AH: DV 株，≥104 TCID50/头份），D组接种无菌生理盐水。4.5月龄时，A组和C组接种1头份灭活疫苗（疫苗同试验1）。B组则再接种1头份活疫苗。一个月后（5.5月龄）C组动物第三次接种灭活疫苗，其他猪接种生理盐水。灭活疫苗与活疫苗毒株的ORF5的同源性大于95%，ORF7同源性为100%. 6.5月龄时所有动物攻毒，观察21天。
试验开始前，两个试验的猪均确定为PRRSV抗体阴性，猪肺炎支原体，猪流感病毒阴性。开始前PCV2抗体阳性，但之后为转血清阴性，说明该抗体为母源抗体。
免疫期间和攻毒后0，3，7，14，21天采血。每个血样采两份（类肝素酶处理采血管和硅化处理采血管）。血清用于检测病毒血症，PRRSV特异性抗体和中和抗体。类肝素酶处理的抗凝血用于获得外周血单核细胞（PBMC），用ELISPOT检测IFN-γ，用ELISA检测IL-10.
体液免疫
用ELISA检测PRRSV特异性抗体。攻毒期间使用PRRSV分离毒株（如2749分离株）检测中和抗体变化。简单来说就是将50 μL血清样品用细胞培养基进行2倍到128倍连续稀释。稀释后与50 μL，200 TCID50的PRRSV 2749株病毒悬液混合。病毒血清混合液37℃孵育1小时，加入MARC-145细胞的96孔板中，一份样品三个孔，37℃，5% CO2孵育3天。用IPMA监测细胞感染情况。另外，试验1 的猪在攻毒后14和21天，试验2的猪在4.5月龄，5.5月龄和攻毒后14天检测中和抗体。
细胞免疫评估
两个试验的猪免疫期间每个月监测一次细胞免疫，攻毒后7，14，21天监测细胞免疫的变化。包括ELISPOT检测细胞介导的PRRSV特异性免疫反应，商品化单克隆抗体检测IFN-γ分泌细胞（IFN-γ-SC）的数量。简而言之，先将5×105, 2.5×105和1×105的PBMC用PRRSV分离株2749株处理，病毒量按照感染复数（MOI）为0.01计算。没有被处理的细胞和PHA处理的细胞（10 μL/mL）分别作为阴性和阳性对照。PRRSV特异性IFN-γ-SC数量由病毒处理的数量减去未被处理的空斑点的数量计算而得。IFN-γ-SC频率按照106 PBMC反应细胞的数量来表达。
为了评估灭活疫苗免疫是否能够诱导白介素10（IL-10）产生，对试验1中样品的PBMC进行了IL-10的检测。简而言之，将5×105细胞用PRRSV分离株2749株处理20个小时，MOI为0.01. 之后按照先前报道的方法，使用商品化单克隆抗体检测细胞悬液中IL-10的表达情况。细胞因子浓度（pg/mL）按照厂家给出的标准进行计算。病毒特异性IL-10浓度由病毒处理孔的值减去对照孔浓度得到。
病毒血症检测
两个试验中，动物在攻毒当天和攻毒后3，7，14，21天采血。提取的血清使用巢式RT-PCR检测PRRSV的情况。试验1中，攻毒当天和攻毒后 3，7天采集鼻拭子也进行PRRSV抗原的检测。
统计分析方法
数据使用StatDirect v2.7.7进行统计分析。使用Kruskal-Wallis检验和Conover-Inman方法对各组平均数进行比较。阳性率使用X2检验进行比较。
结果
临床症状和体温
两个试验中，疫苗免疫组和对照组的动物均未出现或者表现非常微弱的呼吸道症状。没有猪表现发热情况。
体液免疫
表2a和b总结了ELISA检测情况。试验1中，9/14（64%）的猪在攻毒前血清转阳。攻毒后，A组和B组所有猪在试验结束时血清转阳。攻毒前转阳的猪，S/P值在攻毒后没有明显升高。试验2中，所有接种疫苗的猪（A，B，C组）均在2.5月龄时抗体转阳（活苗免疫后1个月）。S/P值在再次免疫或者攻毒后依然没有明显的升高。两个试验中，对照组的猪在免疫期间保持ELISA和中和抗体阴性。
表3a和b总结了中和抗体的结果。试验1中，攻毒前， A组1/7 （14.3%），B组3/7 （42.9%）和抗体为阳性，但是滴度很低（1-3 log2）。攻毒后，A组和B组动物产生了记忆性免疫应答。攻毒后14天，两个免疫组与对照组相比，表现出较高的免疫应答，抗体阳性率较高（A = 7/7；B = 7/7；C = 2/7；P = 0.02）。攻毒后21天的平均值也同样高于对照组（A = 4.0 ± 0.6；B = 4.6 ± 0.8；C = 3.0 ± 0.6；A vs C：P = 0.07；B vs C：P = 0.003）。
试验2中，接种一次活疫苗的动物中和抗体阳性率很低，中和抗体滴度也很低（log2=1）。第二次接种活疫苗的B组在5.5月龄时有4/8（50%）的猪中和抗体转阳，接种灭活苗的A组和C组则有7/16（43.8%）的猪转阳。攻毒时，疫苗免疫组之间，中和抗体阳性率以及抗体平均滴度没有统计学差异。攻毒后14天，所有免疫活苗+死苗的动物检测到中和抗体（A组和C组均为8/8）。而仅免疫活疫苗和对照组中的一些动物仍然没有检测到中和抗体（B组7/8，D组4/8；A = C ＞ D，P = 0.03）。另外，C组中和抗体滴度平均值最高（C =3 .6±1.2；A = 3.2 ± 0.7；B = 2.1 ± 1.3；D = 2.2 ± 0.5；C ＞ B和D；P = 0.02和0.04），攻毒后也升高的最快（P = 0.04）。
PRRSV特异性IFN-γ-SC的分析
图1a和b描述了试验1和试验2中PRRSV特异性IFN-γ-SC的变化情况。试验1中，PRRSV特异性IFN-γ-SC在免疫两次灭活疫苗后开始产生（5.5月龄；平均数±标准差：A = 33± 5；B = 98 ± 5；C = 2 ± 0 , IFN-γ-SC；B ＞ A，P = 0.005; B ＞ C，P ＜ 0.0001；A ＞ C，P = 0.001）。两个免疫组在6.5月龄攻毒前的IFN-γ-SC平均值达到最大（A = 83±23，B = 124 ± 34；A = B； A ＞ C， P = 0.0014； B ＞ C， P＜ 0.0001）。攻毒导致两个疫苗组的PRRSV特异性IFN-γ-SC数量上升：A组从攻毒当天的49 ± 10上升到攻毒后7天的107 ± 19（P = 0.07）；B组则从26 ± 8到59 ± 10（P = 0.004）。之后（攻毒后14到21天）两组没有差异。两个试验中免疫灭活疫苗的猪均有高水平的IFN-γ自发产生（在计算结果里已经减去）。
试验2中，免疫组和对照组在5.5月龄第一次出现显著差异。首免活苗二免灭活苗的猪最高（A = 155 ± 16；B = 75 ± 5；C = 139 ± 19；D = 9 ± 2；A = C ＞ B ＞ D；P ＜ 0.0001）。攻毒当天，三个免疫组的值均高于对照组（P ＜ 0.05），且C组（一次活苗+两次灭活苗）的PRRSV特异性IFN-γ-SC值最高（C ＞ D，P = 0.0002；B ＞ D，P = 0.01；A ＞ D，P = 0.04）。攻毒导致两个二免灭活苗组IFN-γ-SC的值显著升高：A组从攻毒当天的50 ± 25上升到攻毒后7天的103 ± 18；C组则从72 ± 16到173 ± 15（P ＜ 0.05）。攻毒后2周，仅A组和C组出现了比未免疫组和攻毒对照组更高的值。之后所有组的IFN-γ-SC平均值开始下降，但是A组仍然明显高于其他组。（P ＜ 0.02）。
检测试验1的 PBMC中病毒特异性IL-10时发现，在攻毒当天仅A组中有2头猪为阳性，阳性猪的平均值为22.7±9 pg/mL。攻毒后7天每组都只有1头猪为阳性。攻毒后14天，A组有5头，B组有6头，C组有4头为阳性，阳性猪的平均值：A=74.7±36.3；B=110.9±52；C=138.5±75.4 pg/mL。
病毒血症检测
试验1中，攻毒后7，14和21天均未检测到病毒血症，只有一头猪从鼻拭子中检测到了PRRSV。试验2的结果则不同。A组在攻毒后3天有1头出现病毒血症，攻毒后7天2头出现病毒血症；B组仅在攻毒后7天1头出现病毒血症；C组攻毒后3天2头有病毒血症。D组所有猪在攻毒后至少出现过一次病毒血症。（阳性猪比例：攻毒后3天，D ＞ A = B = C；P ＜ 0.02）。
母猪PRRS控制的关键是使母猪群产生并维持一定的免疫水平。如先前的报道，尽管后备母猪和经产母猪的免疫不能提供完全的保护力，但是可以对流产有一定的改善，感染后能减少病毒血症或者鼻腔排毒的持续时间。问题是，如何确保后备母猪和能繁母猪第一次免疫后免疫力可以维持整个生产周期。因而，维持母猪免疫力的有效方案是PRRS控制的关键。
先前的研究中观察到间隔一个月免疫两次灭活疫苗能够诱导高水平的再次刺激机体产生IFN-γ的细胞（CMI）。试验1评估了重复免疫灭活疫苗3次或4次的免疫效果。做两次灭活疫苗基础免疫后比较免疫三次和四次灭活苗的免疫效果。
首免和二免间隔3个月是猪场普遍采用的方式。和先前的报道相同，这个研究中，灭活疫苗一次免疫后没有诱导明显的体液和细胞免疫。但再次免疫后CMI明显提高。
不同组的IFN-γ-SC动态变化和平均值在不同免疫程序中是相似的。这个结果和Piras等（2005）所报道的一致。该研究使用相同的灭活疫苗诱导IFN-γ-SC的产生。IFN-γ-SC位于CD4+CD8αint 和CD4-CD8αhigh之间，可能会诱导活化的辅助T细胞和经典的杀伤性T细胞。
在本研究中，有意思的是IFN-γ-SC在二免后快速上升，但大约一个月后开始下降。PRRSV攻毒诱导IFN-γ-SC显著上升，这跟记忆细胞的变化模式一致。重复免疫灭活疫苗能够产生持续性的基本免疫水平。此外，尽管灭活疫苗在攻毒前很少能有效的诱导体液免疫应答，但是攻毒后免疫灭活疫苗的猪产生了中和抗体，且比未免疫的猪免疫应答快。说明B细胞也和抗原进行了结合。这就可以解释为什么免疫的母猪在感染后具有快速产生免疫应答的能力。
试验中令人吃惊的是，疫苗免疫猪未经处理的PBMC组织也会自发产生高水平的IFN-γ。同样现象在先前有报道。虽然灭活疫苗的成分可以诱导天然IFN-γ释放的原因还未阐明，但暗示可能是疫苗佐剂的原因。本研究中未免疫疫苗的对照动物仅接种了疫苗佐剂，且IFN-γ未在不经处理的PBMC中检测到。说明这不是佐剂的作用。此外，灭活疫苗有诱导PBMC自发分泌IL-10的能力。我们的研究中，仅仅在最后一次免疫PRRS灭活疫苗后1个月的阳性猪（4/14）中才检测到自发产生IL-10的情况。这些结果和Zuckermann等（2007）报道一致。PBMC自发分泌IL-10在免疫后28天开始下降。我们的研究中，攻毒后IL-10的变化和数量在对照组（C组）疫苗免疫组（A和B组）是相似的。暗示IL-10可能主要与先天性抗感染有关。
先前的研究已经阐述了活疫苗和灭活疫苗的组合使用可能是提高抗PRRSV免疫反应的可选策略。试验2中，我们评价了在活疫苗首次免疫后，进行一次和两次灭活疫苗免疫的效果。同时，为了对比活+死组合使用效果，我们也做了两次免疫活疫苗的设计。和预期的相同，所有首免活疫苗的猪由ELISA检测为阳性，之后两种疫苗接种后S/P值均未见明显升高。
尽管如此，三个疫苗免疫组中，中和抗体阳性的动物数量在再次免疫后均增多了。说明再次免疫仅针对一些病毒抗原，而对ELISA板中包被的抗原没有特异性。这些结果也和先前报道的一致。特别是Baker等（1999）推断免疫活疫苗的母猪只有在免疫灭活疫苗时才能激活记忆性免疫。还有一个类似的研究评价了两种疫苗的组合使用效果，证实活疫苗作为基础免疫，灭活苗进行二免的效果比其他免疫方案要好（单独使用灭活苗或者活疫苗；灭活苗做基础免疫，活疫苗做二免）。原因很难确定，但是我们推断可能是灭活疫苗的佐剂或者抗原增强混合物的作用。
关于IFN-γ反应，我们还发现了一个有趣的情况。在试验2中，A组和C组再次接种灭活苗后1个月，我们可以明显观察到免疫记忆反应。虽然B组（活+死）也观察到了，但是反应强度较低。再次免疫后不同组比较，A组，C组与B组之间有显著的统计学差异。这样的差异现象很难弄清楚原因。可能的原因是疫苗使用不同的佐剂，或者活疫苗具有调节免疫应答的潜在能力。这个问题需要进一步的研究。
结论
本研究证明重复免疫灭活疫苗可以激发免疫反应，包括产生中和抗体和CMI，以及攻毒保护效果。此外，与两次弱毒活疫苗免疫相比，活+死的免疫方案可以产生相似的或者更优的中和抗体和CMI水平，以及相似的保护力。下一步研究要确认达到这样保护水平的最小免疫剂量。
原文题目：Comparison of different vaccination schedules for sustaining the immune response against procine porcine reproductive and respiratory syndrome virus
作者：I. Díaz, M. Gimeno, A. Callén等
