复养过程中各类检测手段的灵活应用

非洲猪瘟的准确、快速诊断对于防止 ASF 蔓延、快速扑灭和根除尤其重要。ASFV 自然感染的潜伏期大约为 4—19天 (Wardley et al., 1983)，感染后 7-10 天血液中可检测到抗体。一个地区或猪场首次暴发 ASF 时呈最急性、急性感染临床症状，感染猪只表现为急性出血、死亡，由于首次暴发时发病猪只在抗体出现前就已经死亡，此时首选抗原检测方法。随着病毒循环和扩散，其毒力会下降，感染猪只表现为亚急性和慢性感染临床症状 ，此时抗体检测更适用于疫情的监测和 ASF 根除计划。

当前想复养的猪场比比皆是，但对于如何才能确保复养的高成功率，心里面可能都没有底，加上耳闻目睹的案例是成功的少失败的多，更让一些猪场不知所措。其实，发生了非瘟的猪场复养真的那么难吗？这其中又是哪些环节是真正制约我们的因素？总结国内成功复养场的经验，我认为在复养洗消过程中科学而经济的检测手段必不可少。

一、非瘟病毒在各种环境下的适应力与猪场改造方案紧密关联

表1：《非洲猪瘟的科学观点》

表2：不同环境中的存活能力

表3：非瘟病毒的热耐受能力（多方数据来源）

由表1可以知道以下几个重要参数，非瘟病毒在猪场粪便中仅能存活11天，在被污染的猪圈中至多能存活一个月，但在腐烂的血液中可以存活15周左右的时间，因此在整个洗消过程中清除血迹十分重要，地板缝隙、金属栏杆、墙面、饲槽要做到先浸泡再打上泡沫发泡剂，然后使用高压热水（45度左右）强力冲洗，去除环境中的血迹应该不在话下，之后再以2~3%的火碱喷洒杀灭非瘟病毒；猪场金属栏杆上如果污垢较多，可以用钢丝刷进行强力清洗或者重新上油漆。

复产清扫过程中工程量大的其实是猪舍周边被污染的土壤、木质垫板上的血迹，笔者建议发过非瘟的猪场猪舍之间的道路最好使用C30混凝土进行硬化，猪舍与猪舍间的空地先铲去表层3cm土壤，然后覆盖上生石灰（晴天注意适当浇水），包括死猪深埋处及氧化塘周边也要清除表层部分土壤，再覆盖上生石灰，确保安全。这些铲走的土壤必须混合上生石灰找地方挖坑深埋处理。

而对于那些可能被污染的木质材料、饲料袋、外包装盒等，能焚烧的则全部焚烧，猪舍今后内部不使用木质材料，全部换上钢丝绳绑定电器开关、插座。妊娠限位栏如果是通贯饲槽，建议敲碎重新做成瓷砖通贯水槽或干脆换上单个不锈钢饲槽。

复养是一个系统工程，猪场应该抓住全面清群之后5-8个月时间作适当的改造，新建种猪隔离舍、过渡生活区（人员至少能在其中生活两天），重新规划全场人员行走路线，严格做到净道、污道分开、如上图所示，场内设有专门的进猪通道、专门的出猪通道、专门的死猪处理通道，并在全场地图上标示出来，不能净道、污道混合共用一条道路，那样可能形成交叉感染。每个岗位、每个人的行走路线都要事先规划，严格遵循由净区向污区单向流动原则，人员之间尽量避免交叉污染的可能。新增一些必要的设施和设备，如中转料塔、中转对接平台、中央高压清洗系统（含热水）、PCR检测设备及试剂、员工衣柜、鞋柜、洗手池、洗澡间等，要让员工感觉场内洗澡就象是在外面洗浴中心淋浴一样舒心，购买“飘柔”等名牌洗头膏，使用专门的沐浴露，同时注意浴室防滑设计，甚至可以增加桑拿间，这样员工就不会逃避沐浴，沐浴时间远远超过十分钟，有条件的猪场在淋浴处还配备专门的卫生间，员工换洗下来的衣服马上就可以放进洗衣机（带烘干功能更好）浸泡洗干净，每位员工擦干身体有专门的大浴巾。一个猪场的生物安全水平高低，通过他的洗澡间设施及员工满意度调查基本可知。

二、洗消过程中如何灵活应用各种检测手段？

目前非瘟检测常用的是qPCR方法，qPCR检测最大的缺陷就是检测样本量大时容易造成实验室内的污染，且采样后要送相关实验室等待结果，因此一个实验室每天的检测样数量有着严格的规定，且qPCR检测一个样品的成本基本在20元以上，1000个样那就是20000元，某种程度上成本还是较高的。现场检测究竟有没有更为经济有效的方法呢？

其实是有的。发生非瘟复养场可以在第一遍粗洗、第二遍细洗中科学运用手持ATP检测仪进行检测，因为是手持检测仪器在现场操作更加方便，十几秒钟即能知道哪里洗消存在着死角，从逻辑上讲，如果猪场洗消后设施上还有蛋白和细菌存在，就不要谈ASF病毒能否清除干净；只有在第三遍精洗及消毒后隔半个小时以上才使用qPCR全面检测，这样能有效的节省检测费用，同时也达到洗消检测的目的。下面重点介绍一下ATP荧光检测。

ATP(Adenosine Triphosphate)，中文名为腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷。它普遍存在于细菌等微生物细胞内，ATP是微生物新陈代谢的能量物质。ATP生物发光法是利用ATP试剂中若干组分如荧光素‐荧光素酶等与被测样本反应产生光子，再利用专门研制的荧光检测仪来捕捉和检测发光值，由于被测样本所含细菌等微生物的数量与所含的ATP值、以及ATP值与发光值之间存在一定的函数关系，因此通过检测发光值即能得到被测标本所含细菌等微生物含量。

ATP检测技术实验结果准确可靠，值得信赖。美国多个专业权威机构研究了1000个以上的样品，这种只需十几秒就能完成检测的快速检测法所得到的实验结果90%以上与24‐48小时标准细菌培养法/平皿法所得结果一致。测试饮用水时，比标准法灵敏度大100倍以上，而样品量只要传统方法的1/100。测定结果与传统细菌培养法所得结果相比，相关性高达92‐98%。加拿大食品监查协会经过比对实验后发现，本产品测定结果与标准培养法的相关性是98%。美国FDA推荐使用ATP检测系统和试剂盒用于牛奶细菌数的快速检测。

2010年，国内手持式ATP荧光检测仪和现场快速检测ATP试剂一体化拭子进入批量生产，性能完全能满足食品药品监督部门、卫生监督部门、食品加工行业、餐饮服务行业、航空配餐、大型企业食堂、学校食堂、大型活动保障部门等食品安全涉及环境物体表面检测、手卫生检测、餐饮具表面洁净度检测；化妆品制造业污染控制、医院感染控制、空气细菌污染检测、环境监管部门等污染监管领域细菌检测和表面洁净度检测。我想检测猪场卫生应该更不在话下。

ATP荧光检测法能在十几秒内实现检测，大大提升了传统细菌培养法24‐48小时的工作效率，ATP方法的实现包括仪器、试剂和如何使用三大要素。

仪器为了满足现场快速检测的需求，ATP荧光检测仪宜选择手持式从而实现流动状态即时检测，当仪器和试剂配合使用，整体灵敏度达到10-15～10-18mol/L范围时，可以用于食品表明微生物检测、手卫生检测、餐饮器具洁净度检测。

试剂专用的ATP试剂盒，必须是可去除游离ATP和体细胞ATP，只针对细菌细胞ATP检测，所谓去除干扰物，这是基本要求。其次荧光素酶、虫萤光素、裂解液、取样拭子等组分最好设计成一体化，整体便于现场携带方便检测使用。

如何使用 取样是影响准确性和一致性的关键之一，可按照医院消毒卫生标准等规范要求，参照手持式ATP仪说明书采样、检测、计算得出结果并记录报告。运输车辆及环境清洗参考值设定为80RUL。下面介绍一下ATP荧光仪使用方法。

手持式ATP检测仪，操作十分方便

ATP荧光检测 的优势所在

l灵敏度高—— 10-15～10-18mol/L；

l速度快——常规培养法至少18-24h以上，而ATP只需要几分钟；

l可行性——微生物数量与微生物体内所含ATP有着明确的相关性。通过检测ATP含量，可间接得出反应中微生物数量；

l可操作性——传统细菌培养方法需在实验室由经过培训的技术人员进行操作；而ATP快速洁净度检测操作非常简便，只需简单的培训即可由一般工作人员进行现场操作；

l性价比更高—— ATP生物荧光检测与实验室荧光PCR比，费用大大降低。

总之，科学而实用的ATP荧光检测能节省时间和检测的工作量，同时也能节省检测费用，希望想复养的猪场能把这个检测方法能灵活应用于猪场复养洗消过程中，从而减少qPCR的采样数，减轻实验室的工作量，减少实验误操作的可能性。